Предсказание фенотипов

После успешного выполнения стадии "Предварительная обработка для выявления вариантов" для образцов неопухолевой ткани может запуститься пайплайн предсказания фенотипов, если в анализ была включена хотя бы одна из следующих задач: "Предсказание фенотипов" или "Вычисление полигенных рисков".

При ошибке выполнения любой из перечисленных ниже задач анализ образца останавливается. Однако, если в анализ включены контроль качества и импутация и если образец не удовлетворяет критериям контроля качества, то выполнение стадии "Предсказание фенотипов" останавливается, но анализ образца может продолжиться генерацией отчётов.

Конвертация BAM в VCF#

Для перехода к задачам предсказания фенотипов или вычисления полигенных рисков необходимо сформировать из файла выравнивания образца в формате BAM файл в формате VCF с герминальными вариантами, удовлетворяющими определённым условиям. Эта предобработка отличается для образцов с разными типами секвенирования.

Предобработка образца полногеномного секвенирования#

В случае определения типа секвенирования образца как "WGS" (whole-genome sequencing; полногеномное секвенирование) конвертация файла выравнивания в VCF файл происходит в ходе задачи "Расчет генотипов".

Расчет генотипов#

GATK HaplotypeCaller распознает в файле выравнивания образца сайты герминальных вариантов и надёжные референсные сайты, которые необходимы для расчёта оценки полигенного риска фенотипов. Распознавание осуществляется посредством локальной сборки гаплотипов de novo в активном регионе. Другими словами, всякий раз, когда программа встречает регион с признаками вариации, она отбрасывает существующую информацию о картировании и полностью пересобирает прочтения в этом регионе. Это повышает точность при распознавании регионов, которые традиционно сложно распознать, например, когда они содержат разные типы вариантов близко друг к другу. Для каждого потенциального сайта варианта программа применяет правило Байеса, используя вероятности аллелей с учетом данных прочтения для расчета вероятности каждого генотипа на образец с учетом данных прочтения, наблюдаемых для этого образца. Затем образцу присваивается наиболее вероятный генотип.

Далее варианты аннотируются идентификторами из базы dbSNP (rsId) с помощью bcftools annotate. Получившийся файл сжимается в GZIP архив с помощью bgzip. Его можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Расчет генотипов" ("Скачать VCF_GZ"). Кроме того, файл индексируется с помощью tabix. Получившийся индексный файл можно скачать в том же разделе ("Скачать VCF_TBI").

Предобработка образца полногеномного секвенирования с низким покрытием#

В случае определения типа секвенирования образца как "Low-pass WGS" (полногеномное секвенирование с низким покрытием) конвертация файла выравнивания в VCF файл происходит в ходе задачи "Импутация WGS с низким покрытием", за которой следует обязательная задача "Фильтрация по качеству" (описана далее).

Внимание!

Пайплайн предсказания фенотипов и вычисления полигенных рисков в данных полногеномного секвенирования с низким покрытием является экспериментальным.

Импутация WGS с низким покрытием#

Импутация - это статистический метод восстановления отсутствующих генетических данных на основе анализа гаплотипов в референтной выборке. Сначала происходит распознавание генотипа для данных с низким покрытием с помощью bcftools mpileup и bcftools call. В результате генерируется файл формата VCF, содержащий вероятности генотипа (Genotype Likelihoods; GLs) для каждого сайта из референсной панели. Этот файл далее принимается в качестве входных данных инструментом GLIMPSE. Кроме того, происходит разделение вариантов по хромосомам для параллельной импутации. Затем для более оптимизированного вычисления GLIMPSE chunk разделяет данные на фрагменты для импутации и фазирования и фазирует распространенные варианты. GLIMPSE phase импутирует и фазирует данные секвенирования с низким покрытием. В качестве референсной панели используется панель, созданная на основе коллекции образцов с 30-кратным покрытием из проекта 1000 Genomes Project. GLIMPSE ligate фазирует редкие варианты на скаффолд распространенных вариантов и сшивает все фазированные фрагменты вместе в один файл с целой хромосомой. Наконец, происходит объединение всех хромосом вместе и конвертация в VCF с помощью bcftools concat. Затем этот файл сортируется по хромосомам и сжимается в GZIP архив с помощью bgzip. Получившийся файл с импутированными вариантами в формате VCF можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Импутация WGS с низким покрытием" ("Скачать VCF_GZ"). Кроме того, файл индексируется с помощью tabix. Получившийся индексный файл можно скачать в том же разделе ("Скачать VCF_TBI").

Предобработка образца полноэкзомного или таргетного секвенирования#

В случае определения типа секвенирования образца как "Панель" (секвенирование с помощью таргетной панели) или "WES" (whole-exome sequencing; полноэкзомное секвенирование) конвертация файла выравнивания в VCF файл происходит в ходе задачи "Расчет генотипов" (описана выше), за которой следуют задачи контроля качества, если включен соответствующий параметр "Enable QC and imputation". Контроль качества включает задачи "Нормализация VCF", "Фильтрация по качеству", "Импутация" и завершается повторной фильтрацией по качеству.

На заметку

Если в результате одной из задач фильтрации по качеству образец не проходит проверку контроля качества, то выполнение стадии "Предсказание фенотипов" на этом прерывается, а предсказание фенотипов и/или вычисление полигенных рисков не происходит. Анализ образца может продолжиться генерацией отчётов. Вы можете отключить контроль качества и импутацию, однако результаты в этом случае могут оказаться неудовлетворительными.

Нормализация VCF#

На этом этапе осуществляются проверка того, соответствуют ли референсные аллели в файле референсной последовательности; разбивка мультиаллельных сайтов на биаллельные записи; вывод только первой записи для дублирующихся строк с помощью bcftools norm. Получившийся файл сжимается в GZIP архив с помощью bgzip. Его можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Нормализация VCF" ("Скачать VCF_GZ"). Кроме того, файл индексируется с помощью tabix. Получившийся индексный файл можно скачать в том же разделе ("Скачать VCF_TBI").

Фильтрация по качеству#

Исключение из анализа вариантов, у которых нет информации о сайте (например, ./.), с помощью bcftools filter.
Конвертация файла в формате VCF в бинарный набор файлов, который является способом представления выявленных генотипов, и удаление всех вариантов с одинаковыми идентификаторами, кроме первого встретившегося в файле (варианты без идентификатора пропускаются) с помощью PLINK. Файл с подробным описанием выполнения этой задачи можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Фильтрация по качеству" ("Скачать convert log TXT").
Контроль качества - проверка и удаление несоответствующих критериям образцов и однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) с помощью PLINK. Включает предварительные этапы (проверка доли выявления образцов и ОНП и проверка пола) и итерационные этапы (повторяются итеративно до тех пор, пока ошибки не перестанут находиться).

Проверка данных на наличие образцов с крайне низкой долей выявления. Образцы с высокой долей пропущенных выявлений являются следствием низкого качества ДНК и удаляются из анализа. Порог для доли выявления образцов: > 0.5.
Проверка данных на наличие однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) с крайне низкой долей выявления. Доля пропущенных выявлений ОНП - это доля образцов, генотипы которых не выявлены для данного ОНП. ОНП с высокой долей отсутствующих генотипов (обычно > 5%) предполагают некоторые проблемы с процессом генотипирования, поэтому такие ОНП исключаются из анализа. Порог для доли выявления ОНП: > 0.5.
Проверка пола и удаление образцов с неправильным полом. Проверка пола основана на оценке гетерозиготности X-сцепленных ОНП. По умолчанию коэффициент инбридинга X-хромосомы F < 0,2 определяет пол в образцах как женский, а F > 0,8 — как мужской.
Проверка частоты минорных аллелей (minor allele frequency; MAF). ОНП с MAF < 1% исключаются из последующего анализа, поскольку SNP-чипы, генотипирующие редкие варианты (т.е. локус с MAF < 1%), сложны и подвержены ошибкам. Таким образом, очень низкочастотные аллели, вероятно, являются следствием ошибки генотипирования и могут привести к ложным ассоциациям.
Фильтрация ОНП по доле выявления с порогом > 0.98.
Проверка равновесия Харди-Вайнберга. Согласно допущению Харди-Вайнберга, частоты аллелей и генотипов можно оценить от одного поколения к другому. Отмечается, что отклонение от равновесия Харди-Вайнберга может происходить из-за отбора, популяционного смешивания, загадочного родства, ошибки генотипирования и истинной генетической ассоциации. Поэтому для контроля качества проверяется, не отклоняются ли ОНП от равновесия Харди-Вайнберга.
Фильтрация образцов по доле выявления с порогом > 0.98.
Гетерозиготность образцов. Доля гетерозиготных генотипов в геноме образца может выявить некоторые проблемы с генотипированием, такие как загрязнение образца и инбридинг. Из анализа удаляются образцы, которые отклоняются на ± 3 SD (стандартное отклонение) от средней гетерозиготности образца.
Идентичность по проверке состояния. Высокая степень родства между образцами может привести к усилению ассоциации. Чтобы исследовать загадочное родство, мы рассчитываем матрицу родства и фильтруем образцы с близкими отношениями. Порог идентичности по состоянию: < 0.0925.
Файл с подробным описанием выполнения задачи контроля качества можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Фильтрация по качеству" ("Скачать QC log TXT").

Повторная проверка и фильтрация вариантов и генерация нового бинарного набор файлов с отфильтрованными образцами и ОНП с помощью PLINK.
Файл с подробным описанием выполнения этой задачи можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Фильтрация по качеству" ("Скачать merge log TXT").
Файл с вариантами, удаленными из анализа, можно скачать в том же разделе ("Скачать Skipped variants TXT"). Для каждого варианта указаны причина удаления и номер итерации контроля качества, на которой произошло удаление.
Полный отчёт о контроле качества данных можно открыть в том же разделе ("Открыть QC report HTML").
Файл с образцами, удаленными из анализа, можно скачать в том же разделе ("Скачать Removed samples TXT"). Для каждого образца указаны причина удаления и номер итерации контроля качества, на которой произошло удаление.
Исключение из анализа вариантов, не прошедших фильтрацию, с помощью vcftools.
Сжатие файла в GZIP архив с помощью bgzip. Получившийся файл с отфильтрованными вариантами в формате VCF можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Фильтрация по качеству" ("Скачать Filtered VCF_GZ").
Индексация файла с помощью tabix. Получившийся индексный файл можно скачать в том же разделе ("Скачать Filtered VCF_TBI").

Импутация#

Импутация - это статистический метод восстановления отсутствующих генетических данных на основе анализа гаплотипов в референтной выборке.

Индексация файла VCF с помощью bcftools index.
Разделение вариантов по хромосомам с помощью bcftools view для параллельной импутации.
Определение генотипов и импутация негенотипированных маркеров с помощью Beagle.
Объединение импутированных вариантов, разбитых по хромосомам, в один файл в формате VCF с помощью bcftools concat.
Индексация файла VCF с помощью bcftools index.
Сравнение исходного файла и файла, полученного после импутации, и получение файла с неимпутированными вариантами с помощью vcftools.
Сжатие файла с неимпутированными вариантами в GZIP архив с помощью bgzip.
Индексация файла с неимпутированными вариантами с помощью bcftools index.
Фильтрация импутированных вариантов по порогу DR2 (dosage R-squared) > 0.3 с помощью bcftools filter.
Индексация файла с импутированными и отфильтрованными вариантами с помощью bcftools index.
Объединение неимпутированных и отфильтрованных импутированных вариантов в один файл в формате VCF с помощью bcftools concat.
Индексация объединенного файла с помощью bcftools index.
Файл с подробным описанием выполнения задачи импутации можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Импутация" ("Скачать Impute log TXT").
Файл с неимпутированными и отфильтрованными импутированными вариантами в формате VCF можно скачать в том же разделе ("Скачать Imputed VCF_GZ").
Индексный файл к VCF файлу можно скачать в том же разделе ("Скачать Imputed VCF_TBI").

Определение пола#

Независимо от типа секвенирования, для всех образцов импутируется информация о поле из данных об уровне гомозиготности X-хромосомы. Коэффициент инбридинга X-хромосомы F рассчитывается по следующей формуле:

Если F < 0.2, то пол определяется как женский. Если F > 0.8, то пол определяется как мужской. Если 0.2 < F < 0.8, то пол невозможно определить однозначно.

Значение пола, определённое по генетическим данным, используется для построения отчёта по полигенным признакам. Если это значение не совпадает с указанным вами полом пациента, будет учитываться значение, определённое по генетическим данным.

Вычисление полигенных рисков#

Вычисление полигенных рисков запускается после успешно пройденных шагов предобработки образца, если включен соответствующий параметр.

1. Мультиаллельная нормализация VCF#

Мультиаллельная нормализация VCF - необходимый этап перед вычислением полигенных рисков. Включает выравнивание по левому краю и нормализация инделов; проверку того, соответствуют ли референсные аллели в файле референсной последовательности; объединение биаллельных сайтов в мультиаллельные записи, которые выполняются с помощью bcftools norm. Получившийся файл с нормализованными вариантами сжимается в GZIP архив с помощью bgzip. Его можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Мультиаллельная нормализация VCF" ("Скачать VCF_GZ"). Кроме того, файл индексируется с помощью tabix. Получившийся индексный файл можно скачать в том же разделе ("Скачать VCF_TBI").

2. Вычисление полигенных рисков#

Вычисление полигенных рисков заключается в применении системы линейной оценки к каждой выборке с помощью PLINK. Варианты без информации о сайте (генотип ./. и подобные), без идентификатора или с несовпадающими кодами аллелей не учитываются в анализе. Генетические данные пациента должны включать варианты, представленные в моделе полигенных рисков, за исключением небольшой их доли, устанавливаемой пороговым значением. Вычисление полигенных рисков считается возможным, если генетические данные пользователя содержат не менее 95% всех вариантов, которые представлены в модели.

Оценка полигенного риска (polygenic risk score; PRS) - число, которое суммирует предполагаемый размер эффектов многих однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) на фенотип человека. Для каждого признака значение полигенного риска вычисляется по следующей формуле:

Генотипы закодированы следующим образом: пусть, аллель A - эффектный, а аллель G - неэффектный. Тогда численный код генотипа AA - 2, генотипа AG - 1, а генотипа GG - 0.
Предполагаемые размеры эффектов ОНП рассчитываются на основе данных полногеномного поиска ассоциаций (genome-wide association study; GWAS), который позволяет сопоставить фенотипические признаки с геномными вариантами в человеческих популяциях.
Оценка полигенного риска отражает предполагаемую генетическую предрасположенность человека к исследуемому признаку и может использоваться в качестве предиктора этого признака в предсказательной модели. Другими словами, PRS оценивает, насколько вероятно, что человек будет иметь исследуемый признак, только на основе генетических данных и без учёта факторов окружающей среды.

Вычисляемые полигенные риски:

Рост
Масса тела
Индекс массы тела (ИМТ; Body mass index; BMI)
Предрасположенность к избыточному весу
Предрасположенность к раку предстательной железы
Предрасположенность к раку молочной железы
Предрасположенность к ишемической болезни сердца
Предрасположенность к воспалительному заболеванию кишечника
Предрасположенность к сахарному диабету 2-го типа
Предрасположенность к колоректальному раку

Для каждого риска в результате выполнения задачи формируются три файла, которые можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Вычисление полигенных рисков":

Файл с подробным описанием вычисления риска - "Скачать [название риска] Prs log TXT".
Файл с суммарной оценкой риска для этого образца - "Скачать [название риска] Score TSV". Также этот файл можно открыть в таблицах Google.
Файл со списком идентификаторов вариантов, использованных для вычисления риска, - "Скачать [название риска] Used Variants TSV". Также этот файл можно открыть в таблицах Google.

Предсказание фенотипов#

Предсказание фенотипов (вычисление олигогенных рисков) запускается после успешно пройденных шагов предобработки образца, если включен соответствующий параметр.

1. Нормализация VCF#

Вначале VCF файл нормализуется путём выравнивания по левому краю и нормализации инделов; проверки того, соответствуют ли референсные аллели в файле референсной последовательности; разбивки мультиаллельных сайтов на биаллельные записи; вывода только первой записи для дублирующихся строк с помощью bcftools norm. Получившийся файл сжимается в GZIP архив с помощью bgzip. Его можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Нормализация VCF" ("Скачать VCF_GZ"). Кроме того, файл индексируется с помощью tabix. Получившийся индексный файл можно скачать в том же разделе ("Скачать VCF_TBI").

2. Предсказание фенотипов#

В ходе выполнения задачи вычисляются следующие олигогенные риски:

Цвет волос: вероятность предсказывается по модели, которая использует мультиномиальную логистическую регрессию. Цвет волос определяется по 22 полиморфизмам, модель¹ предсказывает вероятности для 4 категорий: черные, каштановые, рыжие, блонд. Тон волос определяется по 20 полиморфизмам (пересекаются с цветом), модель предсказывает вероятности для темных и светлых волос. Предсказания используются для определения фенотипа по схеме, объединяющей вероятности из обеих моделей.
Цвет глаз: вероятность предсказывается по модели, которая использует мультиномиальную логистическую регрессию. Цвет глаз определяется по 6 полиморфизмам, модель² предсказывает вероятности трех фенотипических признаков: карие, голубые или промежуточные (зелёные) глаза.
Цвет кожи: вероятность предсказывается по модели, которая использует мультиномиальную логистическую регрессию. Оттенок кожи определяется по 36 полиморфизмам. Фенотип кожи определяется по шкале Фицпатрика³. Модель⁴ предсказывает вероятности 5 фенотипических признаков: кожа очень светлого, светлого, промежуточного, тёмного или очень тёмного цвета.
Веснушчатость: вероятность предсказывается по модели, которая использует мультиномиальную логистическую регрессию. Модель⁵ предсказывает наличие веснушек на основе 14 предикторов (один из которых - пол). Она предсказывает 3 категории веснушчатости: отсутствие веснушек, средняя веснушчатость, сильная веснушчатость.
Непереносимость лактозы: модель основана на одном полиморфизме, который полностью ассоциируется с биохимически подтвержденной нестабильностью лактазы⁶. Во вторую и третью очередь рассматриваются некоторые полиморфизмы, которые могут отвечать за вариабельность этого признака для некоторых популяций (финской⁶, восточно-африканской⁷).
Горький вкус: модель основана на 3 полиморфизмах, дающих начало пяти гаплотипам в гене, кодирующем одного из представителей семейства рецепторов горького вкуса TAS2R. Эти гаплотипы полностью объясняют бимодальное распределение вкусовой чувствительности к веществу фенилтиокарбамиду⁸.
Группа крови АВO: модель основана на гаплотипе из двух полиморфизмов⁹.
Метаболиз алкоголя: модель основана на одном полиморфизме, по которому было показано, что замена в нём приводит к образованию почти неактивного фермента ALDH2, который больше не окисляет ацетальдегид до ацетата¹⁰. Наличие даже одного аллеля сильно защищает от алкогольной зависимости. Фактически, защитный эффект этого полиморфизма является наиболее широко воспроизводимой ассоциацией конкретного гена с алкоголизмом¹¹. Еще один полиморфизм, который часто присутствует в исследованиях¹¹, рассматривается во вторую очередь.
Тип ушной серы: модель основана на одном полиморфизме в гене ABCC11¹², который содержит инструкции для белка, который специализируется на перемещении жира в клетки и из них. Люди, у которых есть одна или две копии варианта C в гене ABCC11, имеют больше жира в ушной сере, что делает её тёмной и липкой. У людей, у которых есть две копии варианта T, меньше жира в ушной сере, что делает её сухой, светлой и шелушащейся.
Подмышечный осмидроз: модель основана на одном полиморфизме, который сильно ассоциирован с наличием подмышечного осмидроза¹³.
Фармакогенетика: предсказание рисков применения определенных препаратов, основанное на рекомендациях по применению фармакогенетического тестирования в клинической практике¹⁴.

Название препарата	Маркер	Значение риска	Описание риска и рекомендации
Статины (Аторвастатин, Симвастатин, Флувастатин, Розувастатин, Правастатин)	1 поли- морфизм	0	"Дикий тип" генотипа, не требует коррекции дозы статинов.
		1	Ассоциируется с высоким риском развития миопатии, вплоть до рабдомиолиза, при применении симвастатина, аторвастатина, правастатина или розувастатина. Допускается максимальная доза статинов 40 мг/сутки.
		2	Ассоциируется с высоким риском развития миопатии, вплоть до рабдомиолиза, при применении симвастатина, аторвастатина, правастатина или розувастатина. Допускается максимальная доза статинов 20 мг/сутки.
Такролимус	1 поли- морфизм	0	Нормальная переносимость такролимуса. Отсутствуют аллели, увеличивающие нефротоксичность.
		1	Ассоциируется с развитием нефротоксичности при применении такролимуса с помощью стандартного режима дозирования. Носитель гетерозиготного генотипа более чувствителен к такролимусу, чем носитель гомозиготного генотипа по "дикому типу".
		2	Ассоциируется с развитием нефротоксичности при применении такролимуса с помощью стандартного режима дозирования. Носитель гомозиготного генотипа наиболее чувствителен к такролимусу.
Азатиоприн и 6-меркаптопурин	9 поли- морфизмов	1	Ассоциируется с высоким риском развития гематологической токсичности в первую неделю применения азатиоприна или 6-меркаптопурина, назначаемых в стандартных дозах. Рекомендуется начинать лечение азатиоприном или 6-меркаптопурина с дозы, составляющей 50% от стандартной рекомендованной.
Азатиоприн и 6-меркаптопурин	9 поли- морфизмов	2	Ассоциируется с высоким риском развития гематологической токсичности в первую неделю применения азатиоприна или 6-меркаптопурина, назначаемых в стандартных дозах. Рекомендуется начинать лечение азатиоприном или 6-меркаптопурина с дозы, составляющей 10% от стандартной рекомендованной.
Абакавир	1 поли- морфизм	1	Ассоциируется с развитием синдрома гиперчувствительности при применении абакавира¹⁴. Рекомендуется отказаться от применения абакавира.
Клопидогрел	2 поли- морфизма	1	Отмечается слабый антиагрегантный эффект клопидогрела в связи с нарушением образования его активного метаболита в печени, что является основой генетически детерминированной резистентности к данному препарату. У носителей данных аллельных вариантов, получающих клопидогрел, выше риск сердечно-сосудистых событий, по сравнению с пациентами, не несущими данные аллельные варианты.
Тамоксифен	7 полимор- физмов и делеция гена CYP2D6	1	Ассоциируется с замедлением образования активного метаболита тамоксифена в печени и прогнозирует низкую эффективность тамоксифена у пациенток с постменопаузальным эстрогенпозитивным раком молочной железы.
Иринотекан	1 поли- морфизм	1	Ассоциируется с нарушением биотрансформации активного метаболита иринотекана SN-38, накоплением его в организме и высоким риском развития нейтропении и тяжелой диареи.

Мизофония: модель основана на одном полиморфизме, который связан с более высокой вероятностью чувствительности к звуку жевания¹⁵.
Движение во время сна: модель основана на одном полиморфизме, который ассоциирован с синдромом беспокойных ног и периодическими движениями конечностей во сне¹⁶.
Световой рефлекс чихания: модель основана на двух полиморфизмах, которые связаны со световым рефлексом чихания¹⁷.
Пол: результат задачи "Определение пола", описанной выше.

Получившийся файл с предсказанными фенотипами можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Предсказание фенотипов" ("Скачать Classifier results JSON").

После стадии "Предсказание фенотипов" анализ может продолжиться генерацией отчётов.