Перейти к основному содержимому

Выравнивание

После успешного выполнения стадии "Проверка качества и очистка" для дальнейшего анализа образца (поиска генетических вариантов, структурных вариаций и вариации числа копий, а также предсказания фенотипов) необходимо выполнить выравнивание (картирование) прочтений на референсный геном. Для выравнивания используется наиболее современная версия генома человека - GRCh38.p14. Если выравнивание исключено из анализа, то после успешного выполнения стадий "Загрузка, идентификация и проверка" и "Проверка качества и очистка" анализ завершается. При ошибке выполнения любой из перечисленных ниже задач анализ образца останавливается.

Стадия анализа образца "Выравнивание" может включать следующие задачи:

  1. Проверка и восстановление парности прочтений запускается, если выполняются следующие условия:
    • Анализируется образец парного секвенирования (секвенирование, при котором фрагменты ДНК секвенируют с каждого конца навстречу друг другу);
    • Включены проверка и восстановление парности прочтений и/или количество прочтений в парных файлах образца не совпадает.

Проверка и восстановление парности прочтений производится BBMap Repair. В ходе выполнения задачи происходит следующее:

  • Сортировка строк в файлах.
  • Восстановление порядка в парных файлах: первое прочтение в первом файле должно соответствовать первому прочтению во втором файле и т.д. Порядок восстанавливается за счёт анализа названий прочтений, которые должны быть либо в формате Illumina (идентичный префикс, сопровождаемый "1:" и "2:" или "/1" и "/2"), либо полностью идентичны для обоих прочтений в паре.
  • Восстановление парности прочтений, необходимое для выравнивания, чтобы каждое прочтение из одного файла содержало пару во втором. При очистке прочтений парность может быть нарушена, что приводит к образованию синглтонов - прочтений, которые лишились пары в парном файле. По умолчанию синглтоны удаляются из анализа, но их можно оставить в анализе для выравнивания на геном, если включить соответствующий параметр.
  1. Выравнивание - определение местоположения прочтений образца на референсном геноме версии hg38. По умолчанию выравнивание производится с помощью рекомендуемого сообществом инструмента BWA2 Burrows-Wheeler Aligner (BWA-MEM2) - новейшей и более быстрой версии алгоритма BWA-MEM, который основан на обратном поиске с преобразованием Берроуза-Уилера (BWT) и эффективно и быстро выравнивает короткие прочтения секвенирования на геном человека, допуская мисмэтчи и гэпы1. Этот выравниватель можно поменять в параметрах на BWA Burrows-Wheeler Aligner - более раннюю версию алгоритма BWA-MEM2, Bowtie23, HISAT24 или STAR5. Выравнивание записывается в файл в формате SAM (текстовый файл для хранения биологических последовательностей, выровненных на референсную последовательность).

После выравнивания картированные прочтения сортируются по крайним левым координатам с помощью samtools sort и записываются в файл в формате BAM (бинарный эквивалент формата SAM; занимает меньше места и позволяет быстрее работать с информацией, чем SAM). Получившийся файл можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Выравнивание" ("Скачать BAM"). Также этот файл можно открыть в IGV, нажав на ссылку "Открыть в IGV браузере". Полученный BAM файл индексируется с помощью samtools index. Получившийся индексный файл можно скачать в том же разделе ("Скачать BAI").

На заметку

Если вы хотите добавить в вашу десктопную версию IGV трек выравнивания, полученного в результате анализа загруженного вами образца в Genomenal, вы можете сделать это через ссылку. Для этого сделайте следующее:

  1. Нажмите правой кнопкой мыши на ссылку на файл выравнивания "Скачать BAM" и выберите опцию "Копировать адрес ссылки".
  2. Загрузите трек через URL в вашу десктопную версию IGV, как это описано здесь.
  3. Нажмите правой кнопкой мыши на ссылку на индексный файл выравнивания "Скачать BAI" и выберите опцию "Копировать адрес ссылки".
  4. Добавьте URL индексного файла в соответствующее поле в IGV.
  5. Нажмите "OK". Готово! Трек выравнивания образца добавлен в IGV.

В разделе "Метрики" в деталях задачи "Выравнивание" приведены метрики оценки качества выравнивания:

Для каждой метрики приведены:

  • название метрики;
  • описание результата проверки соответствия определенного показателя выравнивания образца и порога этой метрики: приведены значение показателя для образца (например, доля картированных прочтений в файле выравнивания - Mapped reads) и использованный порог метрики, при котором файл выравнивания считается качественным (можно поменять в параметрах);
  • результат оценки качества выравнивания по метрике: , если выравнивание образца удовлетворяет порогу метрики,
    или , если не удовлетворяет.

Метрики оценки качества выравнивания#

МетрикаЗначение порога метрики, при котором файл выравнивания считается качественным (значение по умолчанию, может быть изменено в параметрах)
Mapped reads (картированные прочтения)В файле выравнивания не менее 85% картированных прочтений.
Multiple alignments (множественные выравнивания)В файле выравнивания не более 15% множественных выравниваний одного и тоже прочтения на геном.
Forward/reverse balance (равновесие прочтений с прямой и обратной цепи)Разница в количестве прочтений с прямой цепи и прочтений с обратной цепи не более 10% в файле выравнивания.
Paired mapped reads (картированные парные прочтения)В файле выравнивания не менее 80% картированных парных прочтений.
Paired properly mapped reads (правильно картированные парные прочтения)В файле выравнивания не менее 75% правильно картированных парных прочтений.
Coverage per nucleotide (понуклеотидное покрытие)Минимально допустимое понуклеотидное покрытие на геноме - 0.1.

Если значение метрики в файле выравнивания образца не удовлетворяет установленному порогу, то файл отмечается как не удовлетворяющий требованиям метрики, т.е. выравнивание завершается успешно, а в статусе стадии указывается количество метрик, которые не соответствуют критериям. Если же никакие прочтения образца не выровнялись на геном, то стадия "Выравнивание" завершается с ошибкой и анализ останавливается.

Если в анализ образца включена хотя бы одна из стадий: выявление соматических SNVs/Indels, герминальных SNVs/Indels, структурных вариаций, вариации числа копий, предсказание фенотипов или вычисление полигенных рисков, то после успешного выполнения задачи "Выравнивание" начнётся выполнение стадии "Предварительная обработка для выявления вариантов".

  1. Определение набора capture kit

Если пользователь определил тип секвенирования образца как WGS (whole-genome sequencing; полногеномное секвенирование), то определение набора capture kit не проводится, а тип секвенирования может остаться WGS или переопределиться в Low-pass WGS (полногеномное секвенирование с низким покрытием). WGS и Low-pass WGS разделяются по среднему покрытию образца: тип секвенирования образцов со средним покрытием меньше 4x определяется как Low-pass WGS, а выше или равно 4x - как WGS.

Если пользователь определил тип секвенирования как Направленный отбор, то тип секвенирования может определиться как Панель (секвенирование с помощью таргетной панели) или WES (whole-exome sequencing; полноэкзомное секвенирование). Далее определяется наиболее подходящий для образца набор capture kit (таргетная панель, используемая при направленном отборе) или вычисляются статистики покрытия образца набором capture kit, выбранным пользователем:

  • bedtools genomecov вычисляет покрытие выровненных последовательностей образца на референсный геном и выдает выходные данные о полногеномном покрытии в формате bedGraph (Файл A).
  • bedtools intersect выявляет совпадения между Файлом A и либо набором capture kit, выбранным для образца пользователем, либо каждым набором capture kit, который встроен или загружен в систему, если пользователь не выбрал capture kit. Для этих capture kit рассчитываются индекс покрытия, глубина, суммарная длина интервалов и длина пересечения покрытия выровненных последовательностей образца с интервалами capture kit, а также процент покрытия.
  • Для capture kit, выбранного пользователем, или для наиболее подходящего набора capture kit среди рассмотренных на предыдущем этапе наборов bedtools complement строит файл со всеми интервалами в геноме, которые не покрыты хотя бы одним интервалом в файле capture kit (Файл B).
  • bedtools intersect находит совпадения между Файлом A и Файлом B, вычисляя индекс покрытия, глубину и длину пересечения этих файлов.

В результате, если пользователь не выбрал capture kit и если в ходе выполнения задачи удалось найти наиболее подходящий для образца набор capture kit, то анализ образца идёт дальше с этим набором. Если подходящий capture kit не удалось найти, то для образца не будут выполнены фильтрация SNVs/Indels (поиск вариантов в тех же геномных интервалах, в которых проводилось таргетного секвенирование) и выявление вариации числа копий. Файл со статистиками набора capture kit, выбранного пользователем или определенного системой, можно скачать в разделе "Файлы с результатами" в деталях задачи "Определение набора capture kit" ("Скачать Capture kit stats JSON").

  1. Vasimuddin M., Sanchit M., Heng L., Srinivas A. Efficient Architecture-Aware Acceleration of BWA-MEM for Multicore Systems. IEEE Parallel and Distributed Processing Symposium (IPDPS) (2019)↩
  2. Li H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arXiv:1303.3997v2 (2013)↩
  3. Langmead B., Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods 9, 357:359 (2012)↩
  4. Kim D., Paggi J.M., Park C. et al. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nat Biotechnol 37, 907:915 (2019)↩
  5. Dobin A., Davis C.A., Schlesinger F. et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29(1), 15:21 (2013)↩